Microscopía láser confocal

Técnico responsable

Javier Gutiérrez Reguera             javier.gutierrez.reguera@uva.es

Tlfs: 983.183475 - 983.184694

Campus de Valladolid

Principios de la técnica

La microscopía láser confocal es una técnica de observación microscópica que está logrando excelentes resultados en diversas ramas de la ciencia (medicina, biología, materiales, geología, etc.) Su éxito se debe a las indudables ventajas que ofrece frente a la microscopía óptica tradicional (imágenes de mayor nitidez y contraste, mayor resolución vertical y horizontal, etc.) y, sobre todo, a la posibilidad de obtener "secciones ópticas" de la muestra, lo que permite su estudio tridimensional. El principio de la microscopía confocal se basa en eliminar la luz reflejada o fluorescente procedente de los planos fuera de foco. Para ello se ilumina una pequeña zona de la muestra y se toma el haz luminoso que proviene del plano focal, eliminándose los haces procedentes de los planos inferiores y superiores.

En la microscopía óptica, el término microscopía de super-resolución (también microscopía de superresolución) se usa para agrupar distintas técnicas que permiten obtener imágenes con mayor resolución que la resolución máxima dada por el límite de difracción. La resolución óptica de un microscopio óptico convencional está limitada por la difracción de la luz, determinado por Ernst Abbe, que a su vez depende de la longitud de onda de la luz usada y la apertura numérica del microscopio. Para un microscopio óptico estándar, con luz del espectro visible, está resolución está en torno a los 200 nanómetros lateralmente y los 600 axialmente 2​. Las técnicas de microscopía de super-resolución permiten resolver objetos de tamaño menores que este límite impuesto por difracción, y pueden llegar al orden de los 10 nanómetros.

Aplicaciones

Imágenes confocales multicanal + imágenes de transmisión de células vivas o muestras fijas (imágenes 2D, 3D, 4D). Microscopía confocal de alta velocidad. Experimentos multidimensionales in vivo time-lapse. FLIM, FRET, FRAP, fotoactivación, exploración lambda de excitación / emisión, imágenes de calcio. Estudios de colocalización subcelular.

Equipos

Microscopio confocal Espectral Leica TC-SP8 Lightning

Consta de los siguientes elementos

Microscopio invertido Leica DMI8

  • fuente de luz de fluorescencia Leica EL6000, con lámpara de metal haluro de 120 W.
  • Iluminación transmitida con LED blanco con regulación de intensidad, obturador automático.
  • bloques de filtros para fluorescencia:

Bloque de filtros

Filtro de excitación

Filtro de emisión

DAPI BP

BP 350/50 nm

BP 460/50 nm

GFP BP

BP 470/40 nm

BP 525/50 nm

RHOD BP

BP 546/10 nm

BP 585/40 nm

  • Dispone de los siguientes objetivos:

Tipo

Aumento/apertura numérica

Inmersión

PL APO CS

10x/0.4

 

PL APO CORR CS2

20x/0.75 IMM

aceite, agua y glicerol

PL APO CS2

40X/1.30

aceite

PL APO CS2

63x/1.4

agua

PL APO CS2

100x/1.4

aceite

 

Módulo confocal ultraespectral Leica TCS SP8 LIGHTNING

  • Sistema de barrido:
    • FOV 22mm
    • velocidad hasta 1.800 Hz (3.600 Hz en modo bidireccional)
    • hasta 7 fps @ 512 x 512 píxeles; 112 fps @ 512 x 16 pixeles.
    • Zoom 0,75x-48x (ratio 64:1) con función de “panning”.
    • Sistema de barrido Tándem:

a) Sistema de barrido de alta resolución con una resolución máxima: 8.192 x 8.192 píxeles, una frecuencia máxima de línea: 3.600 Hz, y un diámetro de campo: >18 mm

b) Sistema de barrido resonante (alta velocidad), resolución máxima: 2.496 x 2.496 píxeles, frecuencia máxima de línea: 16.000 Hz, Diámetro de campo: 13 mm

  • Cámara de alta resolución DFC7000
  • Detectores: 3 espectrales para fluorescencia y reflexión (1 PMT y 2 HyD); 1 (no confocal) Detector de luz transmitida para imágenes de campo claro o contraste interferencial
  • Divisor de haz AOBS (Acousto-Optical Beam Splitter).
  • Láseres:
    • Láser Blanco WLL2, 470 – 670 nm. en pasos de 1 nm (201 líneas de excitación, todas ellas pulsantes), sincronizado con AOBS, hasta 8 líneas simultáneamente.
    • Control por AOTF
    • Láser Diodo CW (405 nm). (50 mW)
    • Sistema de incubación celular para experimentos “in vivo” con control de temperatura, CO2 y humedad,
    • Sistema FALCON: SISTEMA FLIM ESPECTRAL INTEGRADO.
    • Sistema LIGHTNING Módulo de Superresolución, con resolución xy <120nm, resolución z <200nm.

Software

  • LAS X, con los módulos 3D, Navigator, Dye Separation, Colocalización, “LightGate”

 

Equipamiento científico-tecnológico de LEICA MICROSISTEMAS adquirido dentro de la Red de Equipamiento Científico-Tecnológico compartido en Castilla y León denominada «Infraestructuras en Red de Castilla y León (Infrared)» y cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER).

 
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